RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

　　1. ?RNA模板降解?

　　問(wèn)題?：RNA易被RNase降解，導(dǎo)致cDNA合成失敗或產(chǎn)量低。

　　解決方案?：

　　全程冰上操作，使用RNase-free耗材(如槍頭、離心管)?。

　　加入RNase抑制劑(如RiboLock)保護(hù)RNA?。

　　通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性(28S/18S條帶比例應(yīng)為2:1)?。

　　2. ?RNA定量不準(zhǔn)確?

　　問(wèn)題?：RNA濃度過(guò)高(>5μg)或過(guò)低(<100pg)影響逆轉(zhuǎn)錄效率。

　　解決方案?：

　　使用分光光度計(jì)(A260/A280=1.8-2.1)或熒光定量?jī)x精確測(cè)定濃度?。

　　避免過(guò)量上樣，防止高豐度基因優(yōu)先逆轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致定量偏差?。

　　3. ?基因組DNA(gDNA)污染?

　　問(wèn)題?：殘留gDNA干擾qPCR結(jié)果，導(dǎo)致假陽(yáng)性。

　　解決方案?：

　　使用DNase I處理RNA模板?。

　　引物設(shè)計(jì)跨外顯子，避免擴(kuò)增gDNA?。

　　選擇含gDNA去除功能的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒?。

　　4. ?引物選擇不當(dāng)?

　　問(wèn)題?：引物與模板不匹配，導(dǎo)致cDNA合成不完整。

　　解決方案?：

　　Oligo dT引物?：適用于真核mRNA(需polyA尾)，但需高質(zhì)量RNA?。

　　隨機(jī)引物?：適用于原核RNA或降解樣本，但產(chǎn)物片段較短?。

　　混合引物?：Oligo dT+隨機(jī)引物組合可提高全長(zhǎng)cDNA產(chǎn)量?。

　　5. ?RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)影響?

　　問(wèn)題?：高GC含量或復(fù)雜結(jié)構(gòu)阻礙逆轉(zhuǎn)錄酶延伸。

　　解決方案?：

　　65℃預(yù)變性5分鐘破壞二級(jí)結(jié)構(gòu)?。

　　使用耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶。

　　6. ?逆轉(zhuǎn)錄酶活性不足?

　　問(wèn)題?：酶失活或效率低導(dǎo)致cDNA合成失敗。

　　解決方案?：

　　選擇高保真逆轉(zhuǎn)錄酶。

　　優(yōu)化反應(yīng)溫度(42-50℃)和緩沖體系?。

　　7. ?cDNA質(zhì)量驗(yàn)證失敗?

　　問(wèn)題?：無(wú)法通過(guò)PCR或qPCR檢測(cè)目標(biāo)基因。

　　解決方案?：

　　擴(kuò)增內(nèi)參基因(如GAPDH)驗(yàn)證cDNA完整性?。

　　若內(nèi)參正常但目的基因無(wú)擴(kuò)增，需檢查引物設(shè)計(jì)或模板質(zhì)量?。

　　總結(jié)

　　RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格把控RNA質(zhì)量、引物選擇及反應(yīng)條件。若遇問(wèn)題，可優(yōu)先排查模板降解、gDNA污染及酶活性等關(guān)鍵因素?。

　　注：以上僅供參考，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說(shuō)明或咨詢(xún)技術(shù)老師。

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